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| 山羊先進繁殖技術 |
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| 發布日期: 2008-2-3 9:13:24 查看次數：4766 次 |
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不論技術產生的年代和技術的成熟程度及運用時間的長短，下列的技術都應該歸類為先進的山羊繁殖技術：同期發情、人工授精、超數排卵和胚胎移植（MOET）、腹腔鏡活體采卵（LOPU）及胚胎的試管或體外生產技（IVP）、轉基因和克隆技術。
上述先進繁殖技術的運用使山羊的遺傳進展加快。其中的有些技術（如人工授精和胚胎移植）是通過選擇差的加大而使遺偉進展加快，而另外一些技術，如母羔的試管胚胎技術（JIVT）是通過縮短世代間隔而使遺傳進展加快。這些先進的繁殖技術使高價值山羊個休較之在自然繁殖情況下產生更多的后代。而其中有些技術與同期發情技術相結合，使山羊這種季節性繁殖動物能夠在一年中的任何時候都能產羔和泌乳。
人工授精是運用最廣泛的先進繁殖技術，這種技術對全世界家畜的遺傳改進作出了最為顯著的貢獻。人工授精技術結合適當的公畜評定方法（后裔測定），為高價值基因的傳播提供了相對簡單而廉價的方法。冷凍精液的運用使遺傳材料的國際交換更為容易，并使精液在繁殖季節和非繁殖季節都能使用，還延長了高價值公羊的有效繁殖生命（死后也能使用）。
人工授精和同期發情是山羊生產管理中的關鍵技術，使配種和分娩時間集中，能在一年中的預定時間銷售肉和奶，這有利于銷售策略的制定和用于其它目的。
超數排卵和胚胎移植技術是針對母畜的，而人工授精是針對公畜的，也就是說這種技術使高遺傳價值的母羊較之在自然繁殖的情況下生產更多的后代。雖然這種說法在理論上是正確的，但由于各式各樣原因，例如成本、技術要求和該技術效率的不穩定性和不可預知性，使MOET還不可能成為遺傳改進的常用手段。
腹腔鏡活體采卵結合胚胎的試管生產能夠使高遺傳價值的母山羊生產更多的后代。這種技術較之手術胚胎回收技術的手術創傷小，因而在母山羊的繁殖生命中可多次重復使用該技術，而且這種技術的可預知性要好于超數排卵技術。
如果轉基因和體細胞核轉移（SCNT）技術的效率更高并且成本不太昂貴，就能夠在加快或促進遺傳進展上發揮重要作用。目前該技術在山羊中的應用主要是為了產生和繁殖這樣的轉基因山羊，其山羊奶中含有高價值重組藥物蛋白。
現將上述先進技術分別介紹如下：
1 同期發情
同期發情是對母羊群用外源性激素進行處理，或通過改變管理措施，使之發情相對集中在一定時間范圍內的技術，亦稱發情周期化。同期發情是組成先進繁殖技術綜合方案的關鍵部分，對方案總的效率產生重要影響。由于山羊是季節性繁殖動物，因而在非繁殖季節實施人工授精、超數排卵和腹腔鏡活體采卵等技術時，同期發情具有重要的作用。同期發情技術的運用有利于山羊人工授精的推廣和山羊的品種改良，便于山羊生產的組織和管理及降低配種費用。
山羊同期發情技術中使用最為廣泛的方法是用孕酮或孕激素處理9~11天，然后在陰道海綿栓取出前48小時用前列腺素（或類似物）進行溶黃體處理。根據激素處理的有效部位，孕酮或孕激素的處理可通過陰道海綿栓、CIDRA（新西蘭制造，是以尼龍為芯，外面為醫用彈性硅酮制成，并浸潤有天然孕酮）或皮下埋植的方法進行。
為了人工授精，也是為了胚胎移植受體的同期發情，在取出陰道海綿前48小時，用250~500IU的馬絨毛膜促性腺激素（eCG）（溶黃體制劑）進行處理。eCG能夠促進卵泡的發育和同期排卵，使人工授精和胚胎移植在預定的時間進行。eCG的使用劑量應根據季節、品種、體重、年齡、期望的產羔數和個體在以前對這種藥物的響應進行調整。
有報導表明，反復使用eCG導致在通常確定的人工授精時間造成受胎率下降。其原因是由于以前的處理所產生的抗eCG的抗體存在造成的。這種抗體的存在顯然與發情出現時間的延遲有關，同期發情母羊的LH峰值和排卵時間就說明了受胎率低的原因。
采用孕激素長時間處理的方案（18~21天）時，并不需要使用溶黃體藥物，但會導致受胎率下降，這可能是由于精子在生殖道的通過速度減慢造成的。
Rubianes et al. (2003)提出使用“短時間誘導同期發情方案”，即山羊用孕激素處理5天，在陰道海綿栓或CIDR撤出時用eCG200~300IU進行處理。他認為孕激素的處理超過5天會使大量的大卵泡過度生長和存在，從而降低人工授精的受胎率。他所提出的“短時間誘導同期發情方案”結合eCG處理，并在撤出陰道海綿栓54小時進行鮮精的人工授精，使受胎率達到68%。
在發情時給予促性腺釋放激素（GnRH）可以使排卵的同步性更好一些(Pierson et al., 2003)。這種方法可以提高人工授精的受胎率，也有利于在特定的發育階段采集轉基因和體細胞核轉移的卵母細胞和核顯微注射的受精卵。
2 人工授精
人工授精是最早運用的先進繁殖技術，它對家畜的遺傳改進做出了最大的貢獻，因為它對于識別和運用高遺傳價值的公畜提供了最好的方法。精液的三種保存方法（新鮮精液、低溫精液和冷凍精液）和授精的三種技術（陰道、子宮頸和子宮內）已經在山羊這種動物廣泛應用。
當公羊本身就在羊群中時，特別是當繁殖季節中，精液的產量和品質都處于最佳狀態時，新鮮精液的就是首選的保存方法。當范圍不大的地區有許多養羊戶共同使用一只公羊時，通常就采用低溫精液的保存方法。在這種情況下，精液可在4度左右保存，保存時間為24小時（從采精時計算）。冷凍精液是長期保存方法，它可以一年到頭在非常廣闊的地區使用，在公羊死后它的遺傳物質仍然能夠保存下來。
在20世紀40~50年代就已經實現了牛精液的冷凍保存。在這之后，一直摸仿牛冷凍精液的制作方式進行山羊精液的冷凍，但效果不好。早在50年代就發現山羊尿道球腺的分泌物含有卵黃凝集酶。在有鈣元素的情況下，它將卵黃的卵磷脂水解成脂肪酸和溶血卵磷脂。當山羊精液的的緩沖液中含有卵黃時，會釋放出大量的溶血卵磷脂，它對山羊精子有很大的毒害作用，因而山羊精液的冷凍技術是很復雜的。有人建議山羊精液在冷凍保存前冼滌兩次以除去對精子活力和呼吸有害的外源性底物。這種冼去精清的技術提高了冷凍前后試管中精子的存活率，從而提高了山羊冷凍精液的受精率。但是使用不需要冼去精清的稀釋液，可以使山羊冷凍精液的制作過程簡單一些。近來已經開發出不含生物成分的稀釋液，它能提高山羊精液處理的衛生安全性(Hinsch et al., 1997; Gil et al., 2003)。雖然這類稀釋液最初是從牛的稀釋液開發出來的，但是H. Baldassarre等人在山羊精液冷凍中使用了法國的Bioexcell產品，結果表明在山羊精液稀釋前不需要對其進行離心冼滌處理。
一般來說，精液保存的方法就指出了人工授精的首選方法。精子在保存過程中受到的傷害越大，那么輸精的位置就要越深，才能達到好的受胎率。新鮮精液在陰道內輸精是成功的，而對于冷卻精液和冷凍精液則需要進行子宮頸內輸精。可是為了達到高的受胎率（高于70%），冷凍精液需要進行子宮內輸精。對于許多成年母山羊可以通過子宮頸將精液輸入子宮內，而對于青年母山羊及某些成年母山羊個體，就只能夠使用腹腔鏡技術才能達此目的，這就使輸精技術變得更為復雜。
Maxwell等人(1999)證實，解凍精液在精清中的再懸浮可提高綿羊子宮頸輸精的受胎率。這種方法在山羊的運用還未達到類似的結果，這有待進一步進行試驗。
人工授精中利用性別精子可增加山羊的繁殖效率，特別對于奶山羊更是如此，因為生產的公羔沒有大的商業價值。性別精子的利用在一些畜種都獲得成功，如牛(Seidel et al., 1999)，馬(Buchanan et al., 2000)，豬(Rath et al., 2003)和綿羊(Hollinshead et al., 2002)。但是在山羊還未獲得成功。預計這種技術今后也能運用于山羊。。
3 超數排卵和胚胎移植
人類研究超數排卵和胚胎移植（MOET）已有100余年歷史，然而，對畜牧業產生影響是在20世紀70年代以后，牛的MOET首先在北美迅速發展，以后在全世界得到廣泛應用。山羊MOET的首次商業化應用是在1973年，當時的新西蘭為了建立本國的安哥拉山羊群而采用了胚胎移植技術。之后，澳大利亞安哥拉山羊群的迅速擴繁，美國、澳大利亞、新西蘭、德國等國波爾山羊群的建立和擴大，都是利用MOET技術實現的。Holm（1990）用乙二醇作為防凍劑，將丹麥的270枚安哥拉山羊冷凍胚胎運到新西蘭移植，獲得54%的胚胎成活率。McKlvey等人（1992年）也用乙二醇作為防凍劑，將俄羅斯的絨山羊冷凍胚胎運到蘇格蘭移植，獲得53%的胚胎成活率和67%的受胎率。
實踐表明，MOET是所有先進繁殖技術中最讓人困惑的技術，因為MOET的結果有很大的變異性。在標準操作程序沒有變化的情況下，其結果可以從完全失敗到完全成功之間變化。造成這種技術不可預知性的主要原因是：超數排卵響應的變異性，與超數排卵高響應有關的低受精率，黃體的早期退化。這種不可預知的結果，加之胚胎收集和移植的高成本和需要外科手術，就阻止了MOET在山羊改良中的大規模運用。
在成功的MOET操作中，平均每只供體母羊可得到6~8枚可移植胚胎。可是，上述結果因為很多因素（如品種、年齡和營養）而有很大的變異性。每只供體母羊的可移植胚胎數的變化范圍為0~30枚，有25%~50%供體母羊的可移植胚胎因受精失敗和黃體的早期退化而移植失敗。
超數排卵響應的變異性反映出在開始用促性腺激素處理時，存在不受標準超數排卵方案控制的卵泡群(Gonzalez-Bulnes et al., 2003)。這表明可采用一些辦法在FSH處理時避免存在大卵泡和增加新的小卵泡。其中的辦法包括使用促性腺激素釋放激素（GnRH），以及在誘導發情后馬上使用促卵泡素（FSH）。超數排卵處理前一周用澳大利亞的Buserelin埋植物進行預處理并不能提高卵母細胞和胚胎供體的響應(Baldassarre et al.,2001)。很可能GnRH預處理需要超過一周的時間才能抵消垂體促性腺激素的影響，使卵巢產生大量的小卵泡。在超數排卵處理前用Antarelix（GnRH拮抗劑）進行10天預處理，結果在用FSH處理時增加了小卵泡的數量和排卵數(Cognié et al., 2003)。可是，這種超數排卵響應的改進并沒有產生大量可移植胚胎，其原因是受精率低（大于30%）。近來又有人提出“零天方案”來避免大卵泡的有害影響，并提高超排效果(Menchaca et al.2002)。這種方案是基于在排卵后馬上用FSH進行處理，使超排后的黃體數增加30%，但是這個方案只對少數的母羊進行過試驗。而且還沒有報導回收胚胎的數量和質量。
受精率低的部分原因是同期發情后精子在生殖道的輸送能力下降(Evans and Armstrong, 1984)，以及輸精和排卵的時間不吻合。上述第一個問題可通過子宮內（腹腔鏡）輸精予以解決。第二個問題的解決是在發情和人工授精時通過GnRH處理來改進同期排卵，這在前面已述及。Baril et al. (1996)對超排母羊的同期排卵進行了改進，即在取出陰道栓后12小時給予GnRH拮抗劑，在24小時后給予促黃體素（LH）。在同批處理的母羊供體中有30%的個體可能出現黃體早期退化(Pintado et al.,1998)。如果利用腹腔鏡在手術前評定超排響應，當出現明顯的黃體早期退化時，就不應進行沖卵。因為在大多數情況下，回收的幾乎都是未受精的或者退化的卵。黃體早期退化的原因還不完全了解。但是黃體早期退化與營養缺乏、馬絨毛膜促性腺激素的超排和應激等因素有關。Battye et al. (1988)證實，前列腺素涉及到黃體的早期溶解，建議在排卵和回收胚胎之間的時間使用氟胺煙酸甲基葡胺，目的是增加可移植胚胎的回收率。其它防止黃體早期退化的方法是避免利用馬絨毛膜促性腺激素進行超排(Armstrong and Evans, 1983)，以及利用絨毛膜促性腺激素/GnRH進行排卵處理3~4天，目的是中和大卵泡的負效應(Saharrea et al.,1998)。
4 腹腔鏡活體采卵及胚胎的體外生產
利用腹腔鏡采集未成熟卵母細胞進行胚胎的體外生產就能夠克服與標準MOET技術有關的一些問題。這種方法可以多次使用，因為它的創傷小于采集子宮階段胚胎的手術方法。此外，這種方法還可以避免造成超排不良后果的一些因素，如像排卵率低、黃體早期退化和受精率低等。這種方法的可靠性和可重復性都較好。對促性腺激素的響應存在個體變異，而活體采卵方法對每個供體幾乎都能抽吸出5個以上的卵母細胞。這種方法能夠從不能利用人工授精或MOET進行繁殖的個體，如從未性成熟個體獲得后代。活體采卵還能很好地為DNA顯微注射（產生轉基因個體）或核轉移的胞質受體提供合子。
Snyder and Dukelow在1974年首次進行了活體采卵，他們利用腹腔鏡從綿羊的21個卵泡抽吸到6個卵母細胞。但是在發展出胚胎的體外生產技術之前，并沒有充分認識到活體采卵技術的巨大潛力。
活體采卵的方法簡介如下：供體山羊被控制在標準的腹腔鏡臺上，給予全麻。利用一根通過塑料管與采集管相連的針和真空管，在腹腔鏡的觀察下對卵泡進行抽吸。當有經驗的操作者進行抽吸時，根據被抽吸的卵泡數量，每只母羊的操作時間為10~20分鐘，在2~3小時內可采集100枚以上的卵母細胞。
為了采集到優級的卵母細胞，需要用促性腺激素對供體母山羊進行同期發情處理。通常是在腹腔鏡活體采卵前10天，將含有60毫克甲孕酮的陰道海綿栓插入陰道，在插入第八天的早晨給予125微克的Es?鄄trumate (加拿大)。對山羊和綿羊均有人作過不同激素的試驗。其中包括多次注射FSH的方法和一次使用FSH+eCG的方法（腹腔鏡活體采卵前36小時）。H. Baldassarre等人采用一次使用FSH+eCG的方法，在4年中實施腹腔鏡活體采卵1580次，共采集卵母細胞21219枚，平均每只母山羊13.4枚，平均采卵率約為80%。
腹腔鏡活體采出的卵母細胞在體外成熟和體外受精簡介如下：體外成熟是在含有TCM199的50微升懸滴中加入10%休情期山羊血清，并在含有5%二氧化碳、溫度為39度的恒溫恒濕孵化箱中培養24~27小時，體外受精是在含有TALP的50微升懸滴中加入20%休情期山羊血清，并在含有5%二氧化碳、溫度為39度的恒溫恒濕孵化箱中進行受精。授精的新鮮精液濃度為每毫升含1X106精子。兩種配子在箱中共同培養15~20小時。所產生的受精卵或者用于移植到同期受體羊的輸卵管，或者進一步培養到發育的子宮階段。H. Baldassarre等人將體外受精24小時內的胚胎移植到受體羊，出生的山羊羔數占卵母細胞的比例為10%~20%。
腹腔鏡活體采卵及胚胎體外生產技術在商業上的重要價值在于使高遺傳價值山羊在性成熟之前就能產生很多的后代，也就是所謂的母羔體外胚胎生產技術。這種技術能夠縮短世代間隔，并且用促性腺激素處理母羔后的卵泡響應特別顯著。采用前述的一次性處理方法，不需要進行同期發情處理，母羔所采集的卵母細胞幾乎是成年母羊的兩倍。
值得注意的是，這種技術運用于100日齡母羔的情況下，當它產生的后代出生時，這些供體母羔才達到正常的繁殖年齡。因而JIVET技術是腹腔鏡活體采卵及體外胚胎生產的最為有效的運用，因為這種技術能夠縮短世代間隔，加快遺傳進展，產生大量的高價值后代。
5 轉基因的克隆技術
山羊是生產重組蛋白特別有效的動物，因為山羊的產奶量不低，投入和維持成本相對于奶牛較低。奶山羊的產奶量一般為600~800公斤。因而藥用蛋白的產量也不低。如100只轉基因山羊可生產100公斤單克隆抗體，75只轉基因山羊可生產75公斤ATⅢ（抗凝血酶）。其次，如果采用顯微注射的方法生產藥用蛋白，奶山羊從最初的顯微注射到開始含有藥物蛋白的泌乳所需時間是16到18個月（妊娠+生長到性成熟+妊娠），而牛則需要大約3年。由此可見，山羊是生產重組蛋白特別有效的生物反應器。現在，轉基因山羊已經能夠生產大量的藥用蛋白，也能夠從奶中將其提純和進行生物學測定。有幾種產品已經進入臨床試驗，不久就可進入市場（Meade等人，1999）。例如，轉基因山羊生產的ATⅢ已進入Ⅲ期臨床試驗，預計2004年可進入市場；轉基因山羊生產的t-PA已進入Ⅱ/Ⅲ期臨床試驗，預計2006年可進入市場。
產生轉基因山羊的傳統方法是將DNA結構顯微注射到體內來源的前核期受精卵中(Ebert et al., 1991)。這種方法是可靠的，但是效率太低。因為這種隨機整合造成了轉基因結果的未知性（通常出生的轉基因羔羊少于10%），以及表達的未知性（通常每升奶中的重組蛋白為0~10克）。原因是位置效應的作用，即染色體上各個基因不僅獨立發生作用，相鄰基因還能共同發生作用和相互影響（Wall等人，1996）。已有報導利用腹腔鏡活體采卵，通過體外生產受精卵，再進行前核期顯微注射來產生轉基因羊（Baldassarre et al.,2003a)。這種方法增加了每只供體羊的采卵次數，能夠較好地預知產生的胚胎（卵）數，能夠控制對于成功整合起關鍵作用的受精時間和DNA顯微注射時間。在出現第一只克隆綿羊之后（Wilmut et al., 1997），就有可能通過體細胞核轉移來進一步提高產生轉基因山羊的效率。這種方法可以將DNA結構摻入到靶細胞中，隨后根據整合的情況選擇用于轉移的供體細胞。雖然核轉移重組胚胎的繁殖效率大大低于傳統的前核期顯微注射方法（因為前一種方法的受胎率低和較高的死羔率），但是前一種方法所出生的羔羊都是轉基因個體，它們幾乎都能生產高價值的奶重組蛋白(Baldassarre et al., 2003b, 2004b; Wheeler et al., 2003)。
轉基因和體細胞核轉移技術的運用能夠使奶、肉和馬海毛這樣的經濟性狀改進，但尚未看到這方面的報導。除非是生產轉基因羊和克隆羊的技術效率和成本有了非常大的改進，這種技術還不可能廣泛用于山羊生產性能的提高。
總的來說，同期發情和人工授精是山羊遺傳改進中運用最為廣泛的先進繁殖技術，這是由于它們的技術簡單、成本相對較低，而效率卻高。MOET的廣泛運用還需要提高其重復性和降低它的生產成本。MOET將會繼續運用于原種群的繁殖，特別是用于高遺傳價值山羊的國際貿易。腹腔鏡活體采卵和胚胎體外生產對于高價值山羊的繁殖可能更為有效，但是這種技術的利用受限于較之MOET需要更為苛求的實驗室條件。腹腔鏡活體采卵運用于高價值母羔的高效繁殖具有其特殊的意義。JIVET技術與進口貴重山羊冷凍胚胎結合起來，具有非常大的經濟效益。在這種情況下，從冷凍胚胎出生的母羔在性成熟之前可以進行幾次腹腔鏡活體采卵，從而達到快速繁殖的目的。這對于新引進品種（品系）發展的早期階段特別重要。奶、肉和馬海毛這樣的山羊生產性狀的提高可能受益于轉基因技術。但是，對于該技術廣泛運用于提高這些生產性狀的來說，還有待于識別出對特定性狀產生影響的基因，并提高這種技術的效率，以及使達到和評估這種遺傳進展的成本降低。克隆技術也能夠提高轉基因技術在上述運用中的效率。但是需要解決高成本、妊娠率低和成活率低的問題和缺乏遺傳多樣性的問題后，它才能作為家畜改良方法運用于生產。
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